要使 ELISA 測定得到準確的結果，不論是定性的還是定量的，必須嚴格按照規(guī)定的方法制備試劑和實施測定。主要試劑的制備要點已如前述，其他一般性試劑，如包被緩沖液、洗滌液、標本稀釋液、結合物稀釋液、底物工作液和酶反應終止液等，配制時不可掉以輕心。緩沖液可于冰箱中短期保存，使用前應觀察是否變質(zhì)。蒸餾水的質(zhì)量在 ELISA 中也至關重要，最好使用新鮮重蒸餾的。不合格的蒸餾水可使空白值升高。測定的實施中，應力求各個步驟操作的標準化，下面以板式 ELISA 為例，介紹有關注意事項。
（一）加樣
在 ELISA 中除了包被外，一般需進行 45 加樣。在定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性，例如規(guī)定為加樣一滴。此時應該使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中則加樣量應力求準確。標本和結合物的稀釋液應按規(guī)定配制。加樣時應將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出現(xiàn)氣泡。
（二）保溫
在 ELISA 中一般有二次抗原抗體反應，即加標本后和加結合物后，此時反應的溫度和時間應按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各 ELISA 板不應疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。濕盒應該是金屬的，傳熱容易。如用保溫箱，空濕盒應預先放在其中，以平衡溫度，這在室溫較低時更為重要。加入底物后，反應的時間和溫度通常不做嚴格要求。如室溫高于 20℃，ELISA 板可避光放在實驗臺上，以便不時觀察，待對照管顯色適當時，即可終止酶反應。
（三）洗滌
洗滌在 ELISA 過程中不是反應聚，但卻是決定實驗成敗的關鍵。洗滌的目的是洗去反應液中沒有與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)以及在反應過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯待塑料對蛋白質(zhì)的吸附作用是普遍性的。
因此在 ELISA 測定的反應過程中應盡量避免非特異性吸附，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在標本和結合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯（吐溫，Tween）一類物質(zhì)即右達到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水脂肪酸酯，為非離子型的表面張力物質(zhì)，常作為助溶劑。根據(jù)脂肪酸的種類而對聚山梨酯編號，結合月桂酸的為聚山梨酯 20，在 ELISA 中最為常用。它的洗滌效果好，并具有減少非特異性吸附和增強抗原抗體結合的作用。
洗滌如不*，特別在最后一次，如有酶結合物的非特異性吸附，將使空白值升高。另外，在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性 IgG 吸附在固相上而未被洗凈，也將與酶標抗體作用而產(chǎn)生干擾。
ELISA 板的洗滌一般可采用以下方法：①吸干孔內(nèi)反應液；②將洗滌液注滿板孔；③放置 2 min，略作搖動；④吸干孔內(nèi)液，也可傾去液體后在吸水紙上拍干。洗滌的次數(shù)一般為 3～4 次，有時甚至需洗 5～6 次。
（四）比色
如陰性對照顏色極淺，在定性測定中一般可采用目視比色。如用比色計測定結果，準確性決定于 ELISA 板底的平整與透明度和比色計的質(zhì)量。
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