實(shí)驗(yàn)開始前，各試劑和樣本均應(yīng)平衡至室溫；樣本復(fù)融后需再次離心，取上清檢測(cè)；試劑或樣本配制時(shí)，需充分混勻并盡量避免起泡；標(biāo)曲和樣本建議做復(fù)孔檢測(cè)。
1. 加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品工作液依次加入到前兩列孔中，每個(gè)濃度的工作液并列加兩孔，每孔50 μL。待測(cè)樣品加入到其他孔，每孔50 μL(若樣本濃度高于檢測(cè)范圍，需用標(biāo)準(zhǔn)品&樣本稀釋液稀釋后取樣)。立即每孔加入配好的化抗體工作液50 μL。混勻，給酶標(biāo)板覆膜，37℃孵育45分鐘。提示：加樣時(shí)將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡。加樣時(shí)間宜控制在10分鐘內(nèi)。
2. 洗滌：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，浸泡1-2分鐘，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在厚的吸水紙上拍干。重復(fù)此洗板步驟3次。提示：此處與其他洗板步驟都可用洗板機(jī)。每一步洗滌充分是實(shí)驗(yàn)的根本。
3. HRP酶結(jié)合物：每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，混勻，加上覆膜，37℃孵育30分鐘。
4. 洗滌：棄去孔內(nèi)液體，洗板5次，方法同步驟2。
5. 底物：每孔加底物溶液(TMB) 90 μL，混勻，加上覆膜，37℃避光孵育15分鐘左右。提示：根據(jù)實(shí)際顯色情況酌情縮短或延長(zhǎng)孵育時(shí)間，但不可超過30分鐘。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)孔出現(xiàn)明顯梯度時(shí)，即可終止。
6. 終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)。提示：終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物溶液的加入順序相同。
7. 讀值：立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的光密度(OD值)。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀預(yù)熱，設(shè)置好檢測(cè)程序。
8. 實(shí)驗(yàn)完畢后，將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回冰箱保存至保質(zhì)期。
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