熒光定量PCR(Real-time PCR)，是指在PCR擴增反應(yīng)體系中加入熒光基團，通過對擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。
對照的目的是對檢測的各個環(huán)節(jié)進行監(jiān)控，因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。
常規(guī)熒光定量PCR的流程是：樣品采集-運輸-樣品處理-核酸提取-反轉(zhuǎn)錄(RNA病毒)-擴增-結(jié)果讀取。下面看看各個環(huán)節(jié)都可以使用哪些對照？
1、陽性對照和陰性對照
陽性對照和陰性對照是指在相同的處理條件下，比如一份已知的感染樣品和一份已知的未感染樣品，都進行了提取和擴增最終獲得了陽性結(jié)果和陰性結(jié)果。陰陽性對照強調(diào)處理過程與樣品一致，并且有明確的預(yù)期結(jié)果。
2、擴增對照
我們通常說的陽性對照和陰性對照指的是擴增試劑盒中附帶的不需要提取的陽性對照和陰性對照，更準(zhǔn)確的定義應(yīng)該是擴增陽性對照和擴增陰性對照。擴增陽性對照含有陽性擴增模板，擴增陰性對照應(yīng)含有陰性擴增模板(基質(zhì)核酸)。擴增對照只能監(jiān)控每次擴增過程中的擴增系統(tǒng)是否正常，不能監(jiān)控采樣、提取和每份樣品的操作過程。如果是檢測RNA樣品的檢測試劑盒，其擴增陽性對照使用質(zhì)粒，便無法監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄過程。
3、內(nèi)標(biāo)(Internal Control，IC)
內(nèi)標(biāo)是指在同一反應(yīng)管中與靶序列共同擴增的一段非靶序列分子。內(nèi)標(biāo)有兩種形式，一種是使用天然樣品中含有的內(nèi)參基因作為內(nèi)標(biāo)，另一種是人工添加的內(nèi)標(biāo)。內(nèi)標(biāo)的最大特點是與靶序列共同擴增，而其他的對照都是獨立擴增。
3.1 內(nèi)參基因
通常它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，在檢測基因的表達水平變化時常用它來做參照物。內(nèi)參基因通常是持家基因(house-keeping gene)因為其表達水平受環(huán)境因素影響較小，而且在個體各個生長階段的幾乎全部組織中持續(xù)表達變化很小。常用的內(nèi)參基因包括GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、B2M、HPRT和TBP等。
內(nèi)參基因的優(yōu)點是與樣品中的靶基因經(jīng)歷全相同的處理程序，可以監(jiān)控采樣，運輸，核酸提取和擴增的全部過程。缺點是不同物種，不同生理狀態(tài)下，不同組織中的內(nèi)參基因存在一定的差異。如果樣品類型是口腔液，咽拭子等樣品，內(nèi)參基因的量很低可能導(dǎo)致實驗不成立。如果檢測的是環(huán)境樣品則內(nèi)參基因可能全失效。
3.2人工內(nèi)標(biāo)
添加一種不會干擾靶序列擴增的人工合成的內(nèi)標(biāo)?，F(xiàn)在國外的診斷試劑盒大部分都會將內(nèi)標(biāo)直接添加在反應(yīng)液中與模板一起擴增，但是這樣的內(nèi)標(biāo)不能監(jiān)控采樣，運輸和核酸提取的過程。
還有另一種形式的內(nèi)標(biāo)，使用人工合成的假病毒，在核酸提取前在每一份樣品中加入等量的內(nèi)標(biāo)，這樣就可以監(jiān)控樣品的提取到擴增的過程。但是由于是人工添加到樣品中，仍然不能監(jiān)控胞內(nèi)細菌病毒的釋放情況。
4、核酸提取對照
可以使用內(nèi)參基因，假病毒混合基質(zhì)，滅活病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控提取到擴增的流程。
5、反轉(zhuǎn)錄對照(RT control)
可以使用提取好的RNA內(nèi)參基因，RNA假病毒混合基質(zhì)，滅活RNA病毒混合基質(zhì)來監(jiān)控反轉(zhuǎn)錄到擴增的流程。
無反轉(zhuǎn)錄對照(no-RT control)含有除反轉(zhuǎn)錄酶以外的所有成分。
6、空白對照(Blank control)
6.1無模板空白對照
NTC是指不含有模板(陽性模板或者陰性模板)的對照。目前的試劑盒的NC一般都是水或陰性緩沖液，所以NC等同于NTC。其實兩者有不同的作用。
6.2儀器空白對照
NTC是含有引物探針和反應(yīng)液主要監(jiān)控引物探針，反應(yīng)體系有沒有被污染。這里的儀器空白對照我通常使用的是空反應(yīng)管來監(jiān)控儀器有無非特異性的熒光信號。
6.3熒光染料對照
最常使用的是ROX染料，由于熒光定量PCR的熒光信號在每個樣品孔會有微小的差異所以使用特定的ROX熒光染料，系統(tǒng)可以根據(jù)ROX熒光染料的信號值來校準(zhǔn)每孔的熒光信號。
7、質(zhì)控品(Quality control, QC)
上述環(huán)節(jié)中使用的各種對照大部分是試劑廠家匹配試劑盒使用的產(chǎn)品，有的是實驗室自制，所以整個的監(jiān)控過程可能存在不夠客觀和獨立。因此在實驗室的對照設(shè)置中每次檢測都建議使用第三方質(zhì)控品，有條件的使用國家有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(Reference material ,RM)。由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確量值和計量溯源性，可以更準(zhǔn)確的評估整個試驗流程的準(zhǔn)確度。
8、定值參考品
醫(yī)學(xué)上的定量檢測試劑盒，需要配套定值參考品用于試劑盒的定量檢測使用。
對照的選擇：
從上文可知沒有一種對照是美的，在檢測中我們要根據(jù)自己的需求來進行靈活選擇和搭配。建議每一次檢測時添加一個能對從提取到擴增環(huán)節(jié)進行監(jiān)控的質(zhì)控品或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；每份檢測樣品中添加內(nèi)標(biāo)(如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標(biāo)，如果樣品類型為相對固定的動物組織建議使用內(nèi)參基因)；擴增陽性對照，擴增陰性對照，無模板對照和ROX對照。有條件的添加臨床陽性對照和臨床陰性對照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時使用核酸提取對照和反轉(zhuǎn)錄對照。不定期使用儀器空白對照。
