ELISA測定現(xiàn)通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結(jié)果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現(xiàn)分述ELISA常見問題與解決方法：
1. 陰性對照出現(xiàn)陽性結(jié)果
① 樣品、試劑被污染，或加樣時操作不當導(dǎo)致相鄰孔之間溶液濺灑出現(xiàn)交叉污染——更換試劑，小心操作。
② 酶標板洗滌不*——洗板前先將抗體溶液倒干凈，然后清洗液倒?jié)M板孔，確保能充分洗滌。
③ 抗體量過多導(dǎo)致非特異性結(jié)合——根據(jù)說明書的推薦量使用抗體，稀釋抗體到適當濃度。
2．酶標板整體背景高
① 抗體非特異性結(jié)合——應(yīng)確保板孔進行了封閉并且使用的是恰當?shù)姆忾]液以防止非特異性結(jié)合。
② 底物結(jié)合濃度過高——對底物進行適當稀釋。
③ 反應(yīng)時間過長——當酶標板顯色足夠進行吸光度讀數(shù)時立即使用終止液終止反應(yīng)，適當縮短顯色時間。
④ 底物溶液污染——正常底物溶液應(yīng)是澄清透明的，若出現(xiàn)黃色或其他顏色表明受到污染，應(yīng)更換新的底物溶液。
⑤ 底物孵育過程沒有避光——底物孵育應(yīng)在避光條件下進行。
3. 復(fù)孔之間重復(fù)性差
① 樣品數(shù)量不整齊，加樣時間有長有短——加重復(fù)孔時盡量保持加樣時間與第一次接近。
② 加樣量不一致——樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，并且使用同一移液槍。
③ 洗滌條件、操作人員不一致——重復(fù)測定樣品時，操作條件、人員應(yīng)盡可能與上次保持一致。
4. 吸光值偏高或偏低
① 樣品中待測抗原含量太低會導(dǎo)致測定結(jié)果偏低——可嘗試增加樣品使用量。
② 加入抗體量不合適會造成結(jié)果偏低或偏高——使用建議抗體量或為了使結(jié)果更好盡可能調(diào)整抗體的適用量。
③ 孵育時間太短導(dǎo)致檢測結(jié)果偏低——適當延長抗體或抗原的孵育時間，確保待測樣品與檢測抗體能充分結(jié)合。
④ 孵育溫度不適合——應(yīng)保證抗體在最適宜條件下進行孵育（一般37℃孵育1h）。
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